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全新样品制备技术:压力循环技术提取骨骼DNA

2016/7/8 14:47:01

全新样品制备技术:压力循环技术提取骨骼DNA

2016-07-08 



利用压力循环系统提取骨骼DNA



在法医实践研究中,有关DNA的检验已经成为对个体进行识别鉴定的常规技术之一。骨骼是一种比较特殊的生物检测材料,因为外部有坚硬的保护组织,所以相对于人体的其他组织脏器器官的降解比较慢。但对于高度腐化及白骨化的样本来说,骨骼是进行DNA检测的有效检测材料之一。



骨骼DNA

骨骼DNA主要来自于三种细胞,包括骨细胞、破骨细胞以及成骨细胞。由于外层有坚硬的骨密质保护,骨骼较人体的其他组织器官的腐败程度要慢,并在外界环境的影响下,骨骼酶的消化更加缓慢,因此骨骼在更好地保存DNA的同时,也加大了其中DNA提取难度。




由于骨骼中DNA 独有的特性及DNA 含量少, 使得此类检材在DNA提取的方法上存在前处理时间长, 工作强度大, DNA检出成功率低等问题。




传统方法与问题



目前, 已报道的几种骨骼DNA 提取方法如Chelex - 100 法[ 1] , 有机提取法[ 2] , CTAB 法[ 3] , 玻璃奶法[ 4] , 硅珠法[ 5] 等。这些方法一般需要复杂的前处理, 脱钙、有机纯化等步骤, 繁琐的操作步骤加剧了DNA 流失, 也增加了污染的可能。


在低密度病原及一些较难提取样品中,检测及定量分析丝核菌、腐霉菌及其它通过土壤传播的病原体时,尽管利用的是快速诊断装置如实时定量PCR,但结果极其不稳定。原因在于,样品制备在生物样品制备过程中一直是一个瓶颈。一些特殊的DNA,RNA及小分子采用传统的方法无法有效地提取出来。




揭秘新技术——PCT 超高压循环技术

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全自动超高压与常压之间快速循环直接导致细胞膜或核膜的脂质双分子层的平衡状态被打破,脂质双分子膜破坏,进而使细胞内的蛋白或细胞器或细胞核内的DNA、RNA释放出来。


超高压循环技术利用快速交替的高压和低压变换促使细胞溶解或裂解。使用时,将细胞悬浮液或组织放在特别设计的处理容器中(PULSE Tubes),再放在一个压力循环装置中的进行交替的高压和低压处理。哈佛科学家结合压力循环装置和PULSE Tubes共同组成了超高压循环样品制备系统(PBI)特别强调的是, 在PULSETube中,压力可以在小于3秒的时间内增加到 35,000PSI ,在远远小于1秒的时间内从35000PSI回到周界压力,从而这是一项全新的样品制备技术。这项新的专利技术可以在许多已经成熟的和刚刚出现的生物领域中得到广泛应用,包括蛋白组学和基因组学样品前处理,病原体灭活,催化反应的控制,免疫诊断和蛋白质纯化、转录组学等的样品前处理,和蛋白质结构研究。目前,超高压循环样品制备系统主要应用在以下领域:生物技术、抗生素、药物研发、刑侦取证、农业、水产业、环境科学、和古生物学。



关于骨头

由于骨头的坚硬,现在对于从骨头碎片中提取DNA常常包含粉碎的步骤。粉碎过程非常费时,而且不安全,因为粉碎设备常常是反复使用的,容易与其他样品交叉污染。粉碎之后又常常需要脱钙、氯仿抽提等复杂过程。


超高压循环样品制备系统(PBI)是一个封闭的系统结合使用PULSE TUBES一次性的压力循环管有效解决易污染的问题,直接利用高压低压的交替作用, 使DNA能从致密的骨骼组织中直接释放出来, 省去了较长时间粉碎、脱钙和消化步骤,从而提高从骨头碎片中提取DNA的安全性、速度和简便性。



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PULSE TUBES


该系统的优点在于:重现性好,效率高,快速,安全,平行性好。


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在公安部鉴定中心的刑事技术中的《探讨建立利用压力循环技术提取骨骼DNA的新方法》刊文得知,使用11个不同部位骨骼样品分成 3组,一组采用本实验室常规方法处理骨骼,一组采用压力循环仪处理骨骼,另外一组作为阴性对照,然后统一进行DNA的提取及定量。结果采用压力循环技术提取骨骼DNA时间比实验室常规方法缩短24小时以上,提取效率提高6%~49%。结论压力循环技术可以作为一种提取骨骼DNA提取的新方法之一。



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超高压循环样品制备系统(PBI)

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可以作为提取骨骼DNA 的备选设备, 当然利用压力循环仪也可以提取血液、毛发及牙齿DNA。法医上的样品(物证)量常常很小,而且其生物分子活性常常相对比较低。若样品量小(比如头发皮肤和血迹等)而难以对其进行核酸DNA分析时,线粒体DNA同样可以提供一些重要信息,这是由于人类细胞中可含有数以千计的线粒体DNA拷贝但却只有2个核酸DNA的拷贝。而该系统的高压循环技术可安全、有效、快速的提取法医样品中的线粒体DNA。

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1) 样品形态不限,可以是固体(比如动/植物组织、种子、骨头、土壤等),也可以是液体(比如菌液等);
2) 特殊设计的样品管 (PULSE Tube) 保证了样品、环境、操作者的安全,PULSE Tube可兼容多种试剂和溶液;

3) 操作者可以通过调整压力、循环次数和温度等参数,获得最佳提取效果;
4) 只需几分钟,核酸、蛋白质等目标物质即从细胞或组织中快速释放出来;
5) 最高可达35,000 psi作用于样品,可使样品释放高质、足量的生物分子;
6) 样品处理过程中受力均匀,整个过程不产热,不会使热敏感物质降解;
7) 电脑程序精确控制保证持续、均一的样品提取,重现性高;
8) 样品经处理后能直接用于PCR、核酸/蛋白电泳、二维电泳、蛋白印迹、亲和层析等分析。



参考文献:公安部物证鉴定中心《刑事技术》刊文

更多详情,请关注gzcstrace 或电联:020-87511070/ 020-87511229咨询。


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